SMARTEN - Mechanické vlastnosti měkkých materiálů v nanorozměrech

Program INTER-EXCELLENCE, podprogram INTER-COST

Cílem projektu "Mechanické vlastnosti měkkých materiálů v nanorozměrech" je přispět ke standardizaci měření mechanických vlastností měkkých vzorků v nanorozměrech, což je oblast, která má obrovský potenciál pro pokrok v tzv. bio-oborech, s potenciálním přesahem do lékařství, ale i do dalších technologií. Projekt je navržen v rámci programu COST MecaNano(European Network for the Mechanics of Matter at the Nano-Scale,CA21121). Měkké materiály, tj. materiály vykazující Youngův modul pružnosti je typicky nižší než 1 MPa, jako jsou biopolymery, gely a biologické tkáně, mají jedinečné mechanické vlastnosti, které se výrazně liší od jejich protějšků z tvrdých materiálů. Pochopení těchto vlastností v může otevřít nové možnosti v různých oblastech, včetně biomedicínského inženýrství, materiálové vědy a nanotechnologií.

Hlavním zaměřením projektu je standardizace měřících postupů s použitím mikroskopu atomárních sil (AFM) a nanoindentoru určeného pro citlivou indentaci měkkých vzorků. Referenčními metodami budou optická spektroskopie, turbidimetrie, Ramanova a fluorescenční mikroskopie. Pro standardizaci měření budou připraveny referenční vzorky na bázi definovaných fosfolipidických dvojvrstev, biomolekul, hydrogelů a tkáňových kultur. Funkčnost standardizovaných metod a referenčních metod bude ověřena v rámci intra- a inter-laboratorních srovnávacích testů, který určí validační parametry.

V souladu se zadávací dokumentací projektu COSTMecaNano se budeme aktivně podílet na spolupráci, edukaci, šíření volně dostupných dat a metodik (Open/Fair Data), diskuzi nad prioritami a vhodnými postupy biomechanických studií. Z genderového hlediska považujeme za důležité zvýšit podíl výzkumnic v nanomechanické vědě prostřednictvím kariérního rozvoje. Z technologického hlediska by měl projekt přispět ke zlepšení a standardizaci nanomechanických testovacích metod prostřednictvím interakce se členy konsorcia projektu COSTMecaNano, ale i dalšími odborníky a či výrobci přístrojů. Výsledkem by pak měly být efektivnější postupy charakterizace mechanických vlastností komplexních materiálů a pochopení vlastnosti v nanoměřítku, ale také jejich vztah k molekulární podstatě některých dějů, a to s přesahem do biologických a biochemických věd, kde tato charakterizace může vést k pochopení souvislostí mezi fyziologickými či chorobnými stavy a změnou mechanických vlastností na molekulární, buněčné či tkáňové úrovni.

 

1. etapa - Standardní metoda charakterizace mechanických vlastností materiálů

1.9.2024 - 31.8.2025

Využití nanoindentačních přístrojů (nanoindentor, AFM) akorelativních mikroskopických technik (kombinace se světelnou a Ramanovskou mikroskopií) při výzkumu, optimalizaci a standardizaciměřících postupů pro nanomechanické studie. V oblasti mechanické analýzy měkkých a kombinovaných materiálů neexistuje v podstatě žádný standardizovaný měřící postup, který by pokrýval materiály o tuhosti pod 1 MPa, případně jejich kombinaci s tužšími materiály. Považujeme proto za esenciální tyto metody lépe charakterizovat a standardizovat, pokud chceme podpořit další výzkum a šíření těchto metod. Je potřeba standardizovat výběr měřících prób (např. kulové indentory), ale i všechny parametry měření. Důležité je také najít konsensus ve zpracování měřených dat, tj. tzv. silových (force-distance, FDC) křivek. Existuje zde velké množství matematických modelů, které se snaží pokrýt měření na různých druzích materiálů. Úzká spolupráce v rámci projektu COST MecaNano je ideální příležitostí, jak taková řešení diskutovat, nacházet a poté nezávisle zkoušet, porovnávat a šířit mezi kolegy a další uživatele.

  • Standardizace měřícího postupu na AFM – plně indentační přístupy, hybridní módy (off-resonance tapping): vliv měřících parametrů, geometrie indentoru (hrotu, kuličky), vliv prostředí.
  • Standardizace měřícího postupu na nanoindentoru: vliv měřících parametrů, geometrie indentoru (hrotu, kuličky), vliv prostředí.
  • Standardizace doplňkových metod pro charakterizaci standardních vzorků – absorbance, turbidimetrie, konfokální mikroskopie, Ramanova mikroskopie.
  • Standardizace zpracování dat: výběr vhodného softwaru pro zpracování naměřených FD křivek (software výrobce přístroje, Gwyddion,AtomicJ, tp.), výběr matematických modelů vhodných pro robustní a opakovatelné zpracování experimentálních dat (Hertz, Sneddon, Maugis,atp.)

 

2. etapa - Příprava a charakterizace standardních vzorků pro nanomechanické studie

1.9.2024 - 31.8.2025

Motivací v tomto kroku je příprava dobře charakterizovaných vzorků vhodných pro kalibraci nanoindentačních měření a zároveň vhodných pro analýzu referenčními metodami (spektroskopie, turbidimetrie, fluorescence, Ramanova mikroskopie). Takové vzorky by měly být připravitelné i v dalších laboratořích (spolupráce a srovnávací studie), referenční metody by pak měly pomoci sledovat jejich časovou stabilitu a reprodukovatelnost přípravy. V oblasti mechanické analýzy měkkých a hydratovaných materiálů neexistuje v podstatě žádný dobře definovaný kalibrační materiál, který by pokrýval oblast Youngova modulu pružnosti pod 1 MPa. Považujeme proto za esenciální, pokud chceme podpořit další výzkum a šíření těchto metod, takový materiál připravit a dobře ověřit jeho vlastnosti a stabilitu.Připravené standardizační vzorky budou dále testovány v rámci spolupráce v konsorciu COST MecaNano, kde se projektoví partneři účastní srovnávacích zkoušek v rámci mezilaboratorních testů. Pro standardizaci měření na jednotlivých úrovních velikostí a tuhostí vzorků budou připraveny tyto typy kalibračních vzorků:

  • Fosfolipidické dvojvrstvy (PLB): pro studium biologických membrán in-vitro je dobré mít standardizovaný model dvojvrstvy založený na stabilní struktuře. Využito bude chemické složení membrány PCPG(phosphocoline:phosphoglycerol), poskytující stabilní a homogenní strukturu. Stabilitu lze také studovat pomocí referenční metody – konfokálnífluorescenční mikroskopie – pomocí specifického barvení PlasMem BrightGreen. Výsledkem bude standardizovaná příprava dvojvrstvy s definovanou hodnotou tloušťky a Youngova modulu pružnosti.
  • Biomolekuly: výhodou AFM je možnost sledovat dynamické děje na úrovni biomolekul, a to včetně změn v jejich mechanických vlastnostech. Pro kalibraci na této úrovni budou použity vzorky kolagenu, který bude polymerován in-situ v kyselém prostředí z prekurzorů. Pro kalibraci velikosti zde použit reliéf D-bandu, pro kalibraci tuhosti pak především matematická analýza naměřených křivek s dobře definovaným indentorem. Obdobně pak bude použit vzorek plazmidové DNA, který lze dobře izolovat a je jednoznačně definovaný svým složením. Pro kalibraci velikosti molekul lze použít známou šířku řetězce DNA a geometrii malého a velkého žlábku v jejístruktuře. Jako referenční metody lze použít kapalinovou chromatografii agelovou elektroforézu, které ověří složení použitého vzorku a jeho kvalitu.
  • Hydrogely: důležité pro pěstování buněk, 3D tisk buněk, cílené doručení léčiv a zvýšení biokompatibility implantátů. Charakterizace jejich mechanických vlastností je esenciální pro jejich vnímání buňkami, se kterými interagují. V této sekci bude použit chemicky síťovaný hyaluronan, hydrogely na bázi polyakrylamidových (PAGE), ale také anorganické hydrogely založené na jedné komponentě, např. na nanostrukturovaných listech hydroxidu hlinitého, které jsou vysoce homogenní a odpadá u nich problém s heterogenitou indukovanou síťovacím činidlem. Referenčními metodami zde jsou nanoindentace a reologie, které materiál charakterizujíve větších celcích.
  • Živé buňky, buněčné shluky a tkáňové řezy: ke standardizaci měření na řezech a buněčných shlucích lze přistupovat principiálně jako k heterogenním hydrogelům. Proto i pro tuto pod-oblast bude použita standardizace pomocí hydrogelů, viz předchozí bod. Jednotlivé a izolované buňky jsou však ve své podstatě složitější systém ke standardizaci. Jednak se jedná o poměrně heterogenní systém ze své podstaty – měkké heterogenní jednotlivé buňky rostoucí na tuhém podkladu. K tomu je potřeba přidat fakt, že rostou na tuhém podkladu, typicky na plastu či skle. Na okrajových částech se projevuje jejich vliv. K tomu je potřeba eliminovat odlišnost buněk rostoucích v různých generacích, tzv. pasážích. To vše bude předmětem standardizačních prací. Jako referenční metodu použijeme charakterizaci pomocí indentoru a sledování složení buněčných kompartment pomocí konfokální barvení cytoskeletu, jádra, ale i extracelulární matrix.

 

3. etapa - Provádění srovnávacích zkoušek

1.3.2025 - 1.3.2026

V rámci této etapy je nutno provést srovnávací zkoušky, a to jak vnitro, tak i mezilaboratorně. Ve třetí etapě tak budeme testovat reprodukovatelnost a robustnost spojení obou těchto složek nanomechanických studií, tj.metodologického přístupu a přípravy standardizovaných a kalibračních vzorků. Toto testování proběhne nejprve vnitrolaboratorně, tj.testování robustnosti a časové stability, vlivu uživatele atp. Dále budou následovat testy formou kruhových mezilaboratorních testů mezi účastníky konsorcia COST MecaNano. Dobrým srovnávacím přístupem mohou být simulace daných měření, pro které jsme v rámci konsorcia domluveni se skupinou Dr. Mathesana. Srovnávací zkoušky budou rozděleny do těchto hlavních fází:

  • Vnitrolaboratorní srovnávací zkoušky – tj. validace metod a přípravy standardních vzorků (robustnost, přesnost, správnost,opakovatelnost, reprodukovatelnost) v rámci jedné laboratoře.
  • Mezilaboratorní srovnávací zkoušky včetně kruhových testů, analogicky s popisem v prvním bodě.
  • Srovnávací studie experimentální měření vs. simulovaná data, v rámci konsorcia projektu COST MecaNano.

 

4. etapa - Aplikace metod v rámci konsorcia COST (MecaNano)

1.8.2025 - 31.8.2026

Nanoindentační a referenční metody, včetně standardizovaných vzorků budou připraveny, optimalizovány a ověřeny v rámci vnitro i mezilaboratorní činnosti, a to včetně simulace dat. V přípravné fázi tohoto projektu se zformovaly dvě skupiny pracovišť – jedna z nich se chce soustředit spíše na standardizační práce, tak jak je to popsáno v plánu etapy 3. Další skupina vědců se zajímá spíše o aplikaci těchto metod při charakterizaci vzorků, které tyto skupiny připravují nebo aplikují ve svém výzkumu. Jedná se většinou o komplexy lipozómů, nanočástice, hydrogely a buňky ve tkáňových kulturách. Samozřejmě i zde je potřeba pamatovat na sdílení myšlenek a edukaci, viz popis následující etapy.

 

5. etapa - Vzdělávací a networkingové akce, publikace dat v otevřeném režimu

1.1.2025 - 31.8.2026

Důležitou součástí projektů COST MecaNano by měly být události, kde bude docházet ke konzultaci dalších prací na projektu, řešení vzniklých problémů, ale také vzdělávání účastníků a šíření nabytých vědomostí a získaného know-how v oblasti nanomechanických studií. Organizace těchto událostí bude řízena jednak potřebami spolupracujících pracovišť, a jednak průběhem řešení projektu– po dokončení určitých etap pak bude zahájena edukativní kampaň. Zadávací dokumentace projektu COST MecaNano klade velký důraz na akce tohoto typu v nejrůznějších obdobách (symposia, workshopy,podíl na konferencích, networkingové akce) a my se s ní v tomto shodujeme. Je to esenciální podmínka pro úspěšný rozvoj, a hlavně pak standardizaci a šíření metod nanomechanického testování. Průběh této etapy bude konzultován s orgány konsorcia COST MecaNano k tomu určenými, tj. SFC a TSOC.

Výsledky: Workshopy, symposia, networkingové akce

Důležitou součástí projektu COST MecaNano je "bezbariérová"publikace dat a měřících postupů pro provádění nanomechanických studií (Open/Fair Data). V těsné návaznosti na Etapy 1-3, budeme publikovat data a postupy nejen v impaktovaném časopise, ale také se budeme aktivně podílet na vzniku webu projektu COST MecaNano, který bude pro tyto účely budován. Aby se poznatky nalezené v průběhu řešení etap 1 až 3 (tj. standardizace metod, přípravy vzorků a také způsoby jejich ověření) dostaly efektivně nejen mezi členy konsorcia, ale také dále mezi širší vědeckou veřejnost, je potřeba je volně zpřístupnit a také svým způsobem popularizovat. A to nejlépe jejich prezentací na menších úzce specializovaných workshopech a sympoziích, které bude v rámci projektu organizovat, ale také na velkých konferencích, kde se budeme snažit přesvědčit o užitečnosti a vhodnosti nanomechanického mapování také vědce mimo tento mateřský obor. Pro výzkumné pracovníky v biologických a biochemických oborech mohou být příklady použití této technologie vhodným argumentem, aby tyto metody začlenily do portfolia metod, které budou standardně využívat. K tomu určitě přispěje i volné sdílení dat a pracovních postupů, včetně postupů pro jejich vyhodnocení a širší implementaci do řešených projektů.

Výsledky: Publikace dat a postupů v rámci politiky OPEN/FAIR data na stránkách projektu a na webu našeho pracoviště.

Vedoucí sdílené laboratoře

Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.
Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.
Vedoucí sdílené laboratoře
Osobní profil

Zástupce

Mgr. Radka Obořilová
Mgr. Radka Obořilová
Specializovaná vědecká pracovnice junior, Zástupkyně vedoucího sdílené laboratoře
Osobní profil