SMARTEN - Mechanické vlastnosti měkkých materiálů v nanorozměrech
Program INTER-EXCELLENCE, podprogram INTER-COST
Cílem projektu "Mechanické vlastnosti měkkých materiálů v nanorozměrech" je přispět ke standardizaci měření mechanických vlastností měkkých vzorků v nanorozměrech, což je oblast, která má obrovský potenciál pro pokrok v tzv. bio-oborech, s potenciálním přesahem do lékařství, ale i do dalších technologií. Projekt je navržen v rámci programu COST MecaNano(European Network for the Mechanics of Matter at the Nano-Scale,CA21121). Měkké materiály, tj. materiály vykazující Youngův modul pružnosti je typicky nižší než 1 MPa, jako jsou biopolymery, gely a biologické tkáně, mají jedinečné mechanické vlastnosti, které se výrazně liší od jejich protějšků z tvrdých materiálů. Pochopení těchto vlastností v může otevřít nové možnosti v různých oblastech, včetně biomedicínského inženýrství, materiálové vědy a nanotechnologií.
Hlavním zaměřením projektu je standardizace měřících postupů s použitím mikroskopu atomárních sil (AFM) a nanoindentoru určeného pro citlivou indentaci měkkých vzorků. Referenčními metodami budou optická spektroskopie, turbidimetrie, Ramanova a fluorescenční mikroskopie. Pro standardizaci měření budou připraveny referenční vzorky na bázi definovaných fosfolipidických dvojvrstev, biomolekul, hydrogelů a tkáňových kultur. Funkčnost standardizovaných metod a referenčních metod bude ověřena v rámci intra- a inter-laboratorních srovnávacích testů, který určí validační parametry.
V souladu se zadávací dokumentací projektu COSTMecaNano se budeme aktivně podílet na spolupráci, edukaci, šíření volně dostupných dat a metodik (Open/Fair Data), diskuzi nad prioritami a vhodnými postupy biomechanických studií. Z genderového hlediska považujeme za důležité zvýšit podíl výzkumnic v nanomechanické vědě prostřednictvím kariérního rozvoje. Z technologického hlediska by měl projekt přispět ke zlepšení a standardizaci nanomechanických testovacích metod prostřednictvím interakce se členy konsorcia projektu COSTMecaNano, ale i dalšími odborníky a či výrobci přístrojů. Výsledkem by pak měly být efektivnější postupy charakterizace mechanických vlastností komplexních materiálů a pochopení vlastnosti v nanoměřítku, ale také jejich vztah k molekulární podstatě některých dějů, a to s přesahem do biologických a biochemických věd, kde tato charakterizace může vést k pochopení souvislostí mezi fyziologickými či chorobnými stavy a změnou mechanických vlastností na molekulární, buněčné či tkáňové úrovni.
1. etapa - Standardní metoda charakterizace mechanických vlastností materiálů
1.9.2024 - 31.8.2025
Využití nanoindentačních přístrojů (nanoindentor, AFM) akorelativních mikroskopických technik (kombinace se světelnou a Ramanovskou mikroskopií) při výzkumu, optimalizaci a standardizaciměřících postupů pro nanomechanické studie. V oblasti mechanické analýzy měkkých a kombinovaných materiálů neexistuje v podstatě žádný standardizovaný měřící postup, který by pokrýval materiály o tuhosti pod 1 MPa, případně jejich kombinaci s tužšími materiály. Považujeme proto za esenciální tyto metody lépe charakterizovat a standardizovat, pokud chceme podpořit další výzkum a šíření těchto metod. Je potřeba standardizovat výběr měřících prób (např. kulové indentory), ale i všechny parametry měření. Důležité je také najít konsensus ve zpracování měřených dat, tj. tzv. silových (force-distance, FDC) křivek. Existuje zde velké množství matematických modelů, které se snaží pokrýt měření na různých druzích materiálů. Úzká spolupráce v rámci projektu COST MecaNano je ideální příležitostí, jak taková řešení diskutovat, nacházet a poté nezávisle zkoušet, porovnávat a šířit mezi kolegy a další uživatele.
- Standardizace měřícího postupu na AFM – plně indentační přístupy, hybridní módy (off-resonance tapping): vliv měřících parametrů, geometrie indentoru (hrotu, kuličky), vliv prostředí.
- Standardizace měřícího postupu na nanoindentoru: vliv měřících parametrů, geometrie indentoru (hrotu, kuličky), vliv prostředí.
- Standardizace doplňkových metod pro charakterizaci standardních vzorků – absorbance, turbidimetrie, konfokální mikroskopie, Ramanova mikroskopie.
- Standardizace zpracování dat: výběr vhodného softwaru pro zpracování naměřených FD křivek (software výrobce přístroje, Gwyddion,AtomicJ, tp.), výběr matematických modelů vhodných pro robustní a opakovatelné zpracování experimentálních dat (Hertz, Sneddon, Maugis,atp.)
2. etapa - Příprava a charakterizace standardních vzorků pro nanomechanické studie
1.9.2024 - 31.8.2025
Motivací v tomto kroku je příprava dobře charakterizovaných vzorků vhodných pro kalibraci nanoindentačních měření a zároveň vhodných pro analýzu referenčními metodami (spektroskopie, turbidimetrie, fluorescence, Ramanova mikroskopie). Takové vzorky by měly být připravitelné i v dalších laboratořích (spolupráce a srovnávací studie), referenční metody by pak měly pomoci sledovat jejich časovou stabilitu a reprodukovatelnost přípravy. V oblasti mechanické analýzy měkkých a hydratovaných materiálů neexistuje v podstatě žádný dobře definovaný kalibrační materiál, který by pokrýval oblast Youngova modulu pružnosti pod 1 MPa. Považujeme proto za esenciální, pokud chceme podpořit další výzkum a šíření těchto metod, takový materiál připravit a dobře ověřit jeho vlastnosti a stabilitu.Připravené standardizační vzorky budou dále testovány v rámci spolupráce v konsorciu COST MecaNano, kde se projektoví partneři účastní srovnávacích zkoušek v rámci mezilaboratorních testů. Pro standardizaci měření na jednotlivých úrovních velikostí a tuhostí vzorků budou připraveny tyto typy kalibračních vzorků:
- Fosfolipidické dvojvrstvy (PLB): pro studium biologických membrán in-vitro je dobré mít standardizovaný model dvojvrstvy založený na stabilní struktuře. Využito bude chemické složení membrány PCPG(phosphocoline:phosphoglycerol), poskytující stabilní a homogenní strukturu. Stabilitu lze také studovat pomocí referenční metody – konfokálnífluorescenční mikroskopie – pomocí specifického barvení PlasMem BrightGreen. Výsledkem bude standardizovaná příprava dvojvrstvy s definovanou hodnotou tloušťky a Youngova modulu pružnosti.
- Biomolekuly: výhodou AFM je možnost sledovat dynamické děje na úrovni biomolekul, a to včetně změn v jejich mechanických vlastnostech. Pro kalibraci na této úrovni budou použity vzorky kolagenu, který bude polymerován in-situ v kyselém prostředí z prekurzorů. Pro kalibraci velikosti zde použit reliéf D-bandu, pro kalibraci tuhosti pak především matematická analýza naměřených křivek s dobře definovaným indentorem. Obdobně pak bude použit vzorek plazmidové DNA, který lze dobře izolovat a je jednoznačně definovaný svým složením. Pro kalibraci velikosti molekul lze použít známou šířku řetězce DNA a geometrii malého a velkého žlábku v jejístruktuře. Jako referenční metody lze použít kapalinovou chromatografii agelovou elektroforézu, které ověří složení použitého vzorku a jeho kvalitu.
- Hydrogely: důležité pro pěstování buněk, 3D tisk buněk, cílené doručení léčiv a zvýšení biokompatibility implantátů. Charakterizace jejich mechanických vlastností je esenciální pro jejich vnímání buňkami, se kterými interagují. V této sekci bude použit chemicky síťovaný hyaluronan, hydrogely na bázi polyakrylamidových (PAGE), ale také anorganické hydrogely založené na jedné komponentě, např. na nanostrukturovaných listech hydroxidu hlinitého, které jsou vysoce homogenní a odpadá u nich problém s heterogenitou indukovanou síťovacím činidlem. Referenčními metodami zde jsou nanoindentace a reologie, které materiál charakterizujíve větších celcích.
- Živé buňky, buněčné shluky a tkáňové řezy: ke standardizaci měření na řezech a buněčných shlucích lze přistupovat principiálně jako k heterogenním hydrogelům. Proto i pro tuto pod-oblast bude použita standardizace pomocí hydrogelů, viz předchozí bod. Jednotlivé a izolované buňky jsou však ve své podstatě složitější systém ke standardizaci. Jednak se jedná o poměrně heterogenní systém ze své podstaty – měkké heterogenní jednotlivé buňky rostoucí na tuhém podkladu. K tomu je potřeba přidat fakt, že rostou na tuhém podkladu, typicky na plastu či skle. Na okrajových částech se projevuje jejich vliv. K tomu je potřeba eliminovat odlišnost buněk rostoucích v různých generacích, tzv. pasážích. To vše bude předmětem standardizačních prací. Jako referenční metodu použijeme charakterizaci pomocí indentoru a sledování složení buněčných kompartment pomocí konfokální barvení cytoskeletu, jádra, ale i extracelulární matrix.
3. etapa - Provádění srovnávacích zkoušek
1.3.2025 - 1.3.2026
V rámci této etapy je nutno provést srovnávací zkoušky, a to jak vnitro, tak i mezilaboratorně. Ve třetí etapě tak budeme testovat reprodukovatelnost a robustnost spojení obou těchto složek nanomechanických studií, tj.metodologického přístupu a přípravy standardizovaných a kalibračních vzorků. Toto testování proběhne nejprve vnitrolaboratorně, tj.testování robustnosti a časové stability, vlivu uživatele atp. Dále budou následovat testy formou kruhových mezilaboratorních testů mezi účastníky konsorcia COST MecaNano. Dobrým srovnávacím přístupem mohou být simulace daných měření, pro které jsme v rámci konsorcia domluveni se skupinou Dr. Mathesana. Srovnávací zkoušky budou rozděleny do těchto hlavních fází:
- Vnitrolaboratorní srovnávací zkoušky – tj. validace metod a přípravy standardních vzorků (robustnost, přesnost, správnost,opakovatelnost, reprodukovatelnost) v rámci jedné laboratoře.
- Mezilaboratorní srovnávací zkoušky včetně kruhových testů, analogicky s popisem v prvním bodě.
- Srovnávací studie experimentální měření vs. simulovaná data, v rámci konsorcia projektu COST MecaNano.
4. etapa - Aplikace metod v rámci konsorcia COST (MecaNano)
1.8.2025 - 31.8.2026
Nanoindentační a referenční metody, včetně standardizovaných vzorků budou připraveny, optimalizovány a ověřeny v rámci vnitro i mezilaboratorní činnosti, a to včetně simulace dat. V přípravné fázi tohoto projektu se zformovaly dvě skupiny pracovišť – jedna z nich se chce soustředit spíše na standardizační práce, tak jak je to popsáno v plánu etapy 3. Další skupina vědců se zajímá spíše o aplikaci těchto metod při charakterizaci vzorků, které tyto skupiny připravují nebo aplikují ve svém výzkumu. Jedná se většinou o komplexy lipozómů, nanočástice, hydrogely a buňky ve tkáňových kulturách. Samozřejmě i zde je potřeba pamatovat na sdílení myšlenek a edukaci, viz popis následující etapy.
5. etapa - Vzdělávací a networkingové akce, publikace dat v otevřeném režimu
1.1.2025 - 31.8.2026
Důležitou součástí projektů COST MecaNano by měly být události, kde bude docházet ke konzultaci dalších prací na projektu, řešení vzniklých problémů, ale také vzdělávání účastníků a šíření nabytých vědomostí a získaného know-how v oblasti nanomechanických studií. Organizace těchto událostí bude řízena jednak potřebami spolupracujících pracovišť, a jednak průběhem řešení projektu– po dokončení určitých etap pak bude zahájena edukativní kampaň. Zadávací dokumentace projektu COST MecaNano klade velký důraz na akce tohoto typu v nejrůznějších obdobách (symposia, workshopy,podíl na konferencích, networkingové akce) a my se s ní v tomto shodujeme. Je to esenciální podmínka pro úspěšný rozvoj, a hlavně pak standardizaci a šíření metod nanomechanického testování. Průběh této etapy bude konzultován s orgány konsorcia COST MecaNano k tomu určenými, tj. SFC a TSOC.
Výsledky: Workshopy, symposia, networkingové akce
Důležitou součástí projektu COST MecaNano je "bezbariérová"publikace dat a měřících postupů pro provádění nanomechanických studií (Open/Fair Data). V těsné návaznosti na Etapy 1-3, budeme publikovat data a postupy nejen v impaktovaném časopise, ale také se budeme aktivně podílet na vzniku webu projektu COST MecaNano, který bude pro tyto účely budován. Aby se poznatky nalezené v průběhu řešení etap 1 až 3 (tj. standardizace metod, přípravy vzorků a také způsoby jejich ověření) dostaly efektivně nejen mezi členy konsorcia, ale také dále mezi širší vědeckou veřejnost, je potřeba je volně zpřístupnit a také svým způsobem popularizovat. A to nejlépe jejich prezentací na menších úzce specializovaných workshopech a sympoziích, které bude v rámci projektu organizovat, ale také na velkých konferencích, kde se budeme snažit přesvědčit o užitečnosti a vhodnosti nanomechanického mapování také vědce mimo tento mateřský obor. Pro výzkumné pracovníky v biologických a biochemických oborech mohou být příklady použití této technologie vhodným argumentem, aby tyto metody začlenily do portfolia metod, které budou standardně využívat. K tomu určitě přispěje i volné sdílení dat a pracovních postupů, včetně postupů pro jejich vyhodnocení a širší implementaci do řešených projektů.
Výsledky: Publikace dat a postupů v rámci politiky OPEN/FAIR data na stránkách projektu a na webu našeho pracoviště.
